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血細(xì)胞分離技術(shù)（二）

山東朱氏藥業(yè)集團(tuán)有限公司2022/11/11 17:16:11

（二）操作方法

1．取抗凝血，自然沉降，如是馬屬動(dòng)物的血液，可直接直立試管架上，讓其自然沉降1h，取上層血漿。如是牛、羊血液，由于其血沉速度非常慢，可加等量3％明膠液，混勻后讓其自然沉降，1h后取上層血漿。

2．2 000r/min離心10min，棄上清。

3．沉淀用Hank’s液混懸后，再2 000r/min離心10min。

4．重復(fù)步驟3一次，再用細(xì)胞營養(yǎng)液將白細(xì)胞制成懸液。此液含有整個(gè)白細(xì)胞群，包括粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和部分紅細(xì)胞�？晒┌准�(xì)胞計(jì)數(shù)用。

5．取2ml細(xì)胞分層液于離心管內(nèi)，同時(shí)用毛細(xì)吸管吸取約2ml的血漿（自然沉降1h的上層血漿）輕輕加入分層液上，直接加抗凝血也可。

6．以水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)2 000r/min離心20min。離心后，可見分成多層，*下層是紅細(xì)胞，中間層是分層液，*上層是血漿。在血漿層與分層液之間是一薄層較致密的白色層，即為單個(gè)核細(xì)胞層。

7．用毛細(xì)吸管插入到單個(gè)核細(xì)胞層并吸取該層，放入另一試管中。

8．以Hank’s液洗滌、離心，*后配制成適當(dāng)?shù)陌准?xì)胞濃度。必要時(shí)可計(jì)數(shù)。




（三）注意事項(xiàng)

1．血漿或血液加入分層液中時(shí)要小心，緩慢不要打亂液層、不要搖動(dòng)。也可以將分層液加入到血漿的上層。

2．保持淋巴細(xì)胞的活性是非常重要的，所以一般情況下，是現(xiàn)采血，馬上進(jìn)行分離。

3．經(jīng)過分層液分離的淋巴細(xì)胞層，實(shí)際上是單個(gè)核細(xì)胞層，包括單核細(xì)胞，不包括粒細(xì)胞。欲分離出純的淋巴細(xì)胞，則按下法除去單核細(xì)胞，或收獲單核細(xì)胞。




T淋巴細(xì)胞的分離技術(shù)




（一）原理  

混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細(xì)胞則通過尼龍毛柱，這是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。




（二）材料及試劑

1．尼龍毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）。

2．燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。

3．裝填尼龍毛柱，一次性注射器。

4．取自然沉降的上層血漿，過聚蔗糖—泛影葡胺分層液后，獲取的血漿和分層液之間的單個(gè)核細(xì)胞層。




（三）操作方法

1．尼龍毛的清洗與干燥

（1）戴上已經(jīng)洗去滑石粉的一次性手套，將尼龍毛（1包或2包，每包35g）放入燒杯中，加入蒸餾水或去離子水，用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。

（2）冷卻至常溫，倒入漏斗內(nèi)，使水滴干。

（3）重復(fù)（1）、（2）步驟6次。

（4）將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內(nèi)，37℃溫箱干燥2～3天后，貯藏在帶蓋的方盤內(nèi)。




2．裝尼龍毛柱

（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。

（2）將尼龍毛梳理，并適當(dāng)折疊，以適應(yīng)注射器的直徑，填入注射器內(nèi)，約20ml的體積。

（3）將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好，高壓滅菌。




3．細(xì)胞分離

（1）將注射器固定在支架上，倒入37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液，關(guān)閉閥門一定時(shí)間，然后打開閥門，放掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以清洗幾次尼龍毛，關(guān)上閥門。

（2）將要分離的細(xì)胞液用預(yù)先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛�，約5.00×107個(gè)細(xì)胞／ml。

（3）將細(xì)胞液倒入注射器內(nèi)，使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器，37℃溫育45min

至1h。

（4）打開下口，緩慢放流（1滴／min），收集于離心管中。

（5）離心，即獲所需的T淋巴細(xì)胞。

（6）關(guān)閉注射器下口，于注射器內(nèi)加入0.85％冰冷生理鹽水，振蕩，并套上注射器芯，打開下口，使勁推出注射器內(nèi)液體，即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。

（四）注意事項(xiàng)

1．此種分離法，T淋巴細(xì)胞也常有一部分被吸附，吸附的多少與尼龍毛的質(zhì)量有關(guān)，與裝柱的松緊也有關(guān)系。

2．此法的T淋巴細(xì)胞的回收率約20％～30％。

3．用過的尼龍毛可回收，以鹽水洗滌，然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜，然后再同前法清洗。




單核細(xì)胞分離技術(shù)




（一）鐵粉吸附法

1．材料及試劑

（1）鐵粉或羰基鐵粉（Atomergic chemetals）99％的純度，顆粒小于60μm（Goodfellow Metals）。

（2）強(qiáng)磁鐵（馬蹄形）。

（3）一塊小棒狀磁鐵（約1cm長）。

（4）毛細(xì)吸管等。

2．操作方法

（1）稱取一定量的鐵粉，一般為10g，用100ml生理鹽水洗滌4次，去除任何可溶性有毒物質(zhì)。在倒去鹽水時(shí)，用強(qiáng)磁鐵吸住鐵粉。

（2）用50ml生理鹽水混懸鐵粉。搖勻后，分裝于10個(gè)瓶中，包扎瓶口，121℃滅菌20min，拿出后立即輕輕搖勻，防止鐵粉結(jié)塊，儲(chǔ)藏備用。

（3）臨用前，倒去瓶中的生理鹽水，加入適量的單個(gè)核細(xì)胞懸液（3ml～5ml，細(xì)胞總數(shù)為8×107個(gè)／瓶）。37℃溫育45min，中間不時(shí)晃動(dòng)，使鐵粉懸浮起來。

（4）加入一塊小磁鐵棒于瓶中，讓其吸住鐵粉以及附著在鐵粉上的細(xì)胞。

（5）倒出懸液，此懸液主要是淋巴細(xì)胞，離心，收集。

（6）在鐵粉瓶內(nèi)倒入一定量的Hank’s液，用力振搖后，以強(qiáng)磁鐵吸附，幾分鐘后，倒出液體。

（7）2 000r/min離心液體，管底即為單核細(xì)胞。




（二）玻璃板吸附法

將分離的單個(gè)核細(xì)胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內(nèi)，置37℃ 30 min～40min，用毛細(xì)吸管輕輕吸取懸液，即為淋巴細(xì)胞。用適量的Hank’s液沖洗平皿，收獲即為單核細(xì)胞懸液。